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ABC-ELISA材料和方法
  • 發布日期:2011-09-27      瀏覽次數:1326
    • BAS酶聯免疫吸附試驗材料和方法

      (以篩選抗空腸彎曲菌共同抗原的單克隆抗體為例)

       

      1 材料 

      (1) 空腸彎曲菌共同抗原提取物,自制。 

      (2) 生物素化羊抗鼠IgG(BSAMG),衛生部上海生物制品所。 

      (3) ABC試劑,衛生部上海生物制品所。如ABC試劑需自己配制,可按說明要求,將親和素與酶標生物素按一定比例混合,置37℃孵育30min后使用。 

      (4) 被檢雜交瘤培養物上清液。 

      (5) 其他試劑及器材同常規ELISA法。 

       

      2 方法ABCELISA間接法程序 

      (1) 用包被液對空腸彎曲菌共同抗原提取物作適當稀釋(1∶16),加入反應孔中,每孔01ml,置4℃包被過夜或37℃1~2h。 

      (2) 用洗滌液洗滌2次,每次1min,瀝干。 

      (3) 加入雜交瘤培養物上清液,每孔01ml。同時作BALB/C小鼠免疫血清(陽性)及正常血清和培養液(陰性)對照,置37℃1~2h。 

      (4) 洗滌3次,方法同上。 

      (5) 用保溫液對生物素化羊抗鼠IgG作適當稀釋(1∶400~1∶1000),加入反應孔中,每孔01ml。置37℃孵育1h。 

      (6) 洗滌3次,方法同上。 

      (7) 用ABC稀釋液或保溫液對ABC試劑作適當稀釋(1∶100),加入反應孔中,每孔01ml。置37℃孵育30min。 

      (8) 洗滌3次,方法同上。 

      (9) 加入鄰苯二胺底物溶液,每孔01ml,置暗盒內室溫顯色適當時間(30min)。 

      (10) 加入2mol/L H2SO4,每孔005ml,終止反應。用酶聯檢測儀檢測結果,并記錄其OD值。

       

      3 結果判定以P/N≥2為陽性,或根據自定標準判定。 

       

      4 注意事項 

      1 ABCELISA中各要素的*反應條件需經篩選后確定,不能照搬常規ELISA的反應條件。 

      2 ABCELISA對抗原和抗體(或免疫血清)的質量要求高,否則可造成較高的本底或背景顯色。 

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